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        免疫組庫(Immune Repertoire,IR)是指某個(gè)個(gè)體在任何特定時(shí)間點(diǎn)其循環(huán)系統(tǒng)中所有功能多樣性B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的總和。T細(xì)胞和B細(xì)胞分別介導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答,分別通過其表面的T細(xì)胞受體(TCR)和 B細(xì)胞受體(BCR)來識(shí)別和結(jié)合抗原,進(jìn)而發(fā)揮功能清除病原體或體內(nèi)腫瘤細(xì)胞。


        免疫組庫高通量測序是通過多重PCR或SMART RACE法擴(kuò)增TCR/BCR全長或CDR3區(qū)序列(主要是TCR的β鏈或BCR的重鏈),再結(jié)合高通量測序技術(shù),對(duì)機(jī)體免疫組庫的多樣性及每種 T、B細(xì)胞克隆的獨(dú)特性序列組成和變化進(jìn)行分析,從而全面評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài),明確疾病與T、B細(xì)胞克隆組成及變化之間的關(guān)系。隨著免疫組庫高通量測序技術(shù)的不斷發(fā)展和成熟,基于免疫組庫多樣性變化特點(diǎn)的生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)、腫瘤等疾病療效預(yù)測、疾病的易感性和抵抗性、感染性疾病及疫苗研究等方面都取得了重要進(jìn)展。


實(shí)驗(yàn)方案
        測序策略: Illumina平臺(tái)  PE150

        數(shù)據(jù)量:1G raw date/樣


樣本要求
        (1)分選的T或B細(xì)胞:建議細(xì)胞數(shù)103-107個(gè),離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運(yùn)輸。
        (2)外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC):建議細(xì)胞數(shù)103-107個(gè),離心后保存于1ml Trizol中并混勻,低溫保存運(yùn)輸。
        (3)新鮮全血:采集外周血于EDTA抗凝管內(nèi),混勻后取 250μl,保存于750μl Trizol LS并混勻,低溫保存運(yùn)輸。
        (4)組織:取50~100mg組織,保存于1ml Trizol中,低溫保存運(yùn)輸。

        (5) 如果客戶自提 RNA,建議最好用進(jìn)口試劑或試劑盒提取,最后溶于無RNA酶的水中。如果是分離的PBMC,RNA濃度大于50ng/μL,總量大于500ng。如果用組織提 RNA,濃度>500ng/μL,總量>5μg。 


技術(shù)優(yōu)勢
        (1)擁有自主發(fā)明專利的UMI標(biāo)記與校正算法(發(fā)明專利號(hào):201810618023.7),對(duì)PCR擴(kuò)增與測序過程引入的錯(cuò)誤與偏倚進(jìn)行有效糾正,極大提高分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。
        (2)采用當(dāng)前免疫組庫擴(kuò)增最有優(yōu)勢的5' RACE法,保證結(jié)果的可靠性和后期研究的方便性;
        (3)針對(duì)微量細(xì)胞樣本(>100個(gè)),可以采用微量建庫技術(shù),大大提高建庫成功率;
        (4)由武漢大學(xué)、中山大學(xué)、南方醫(yī)科大學(xué)以及美國斯坦福大學(xué)研究人員組成的專業(yè)的研究和分析團(tuán)隊(duì),保證研究結(jié)果的可信度和可重復(fù)性;

        (5)運(yùn)用國際認(rèn)可的專業(yè)的免疫組庫分析模塊,并結(jié)合我們自己獨(dú)有的生物信息分析算法,所提供的標(biāo)準(zhǔn)化的分析流程即可滿足科研或臨床所需。另外我們還可提供數(shù)據(jù)的深度分析服務(wù)(需另收費(fèi)).


數(shù)據(jù)分析
        (1)測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估
        (2)克隆的鑒定與計(jì)數(shù)
        (3)不同V/D/J基因的計(jì)數(shù)、頻率和頻率檢驗(yàn)
        (4)不同V/D/J基因組合的計(jì)數(shù)、頻率和頻率檢驗(yàn)
        (5)有顯著差異的克隆型頻率
        (6)CDR3長度分布
        (7)CDR3氨基酸與核苷酸序列的克隆計(jì)數(shù)、頻率和有關(guān)分析
        (8)樣本間CDR3氨基酸序列的相關(guān)性、相似性和多樣性評(píng)估

        (9)樣本間共有克隆分析


技術(shù)流程

        RNA提取和質(zhì)檢-SMART RACE法擴(kuò)增-文庫構(gòu)建-上機(jī)測序-標(biāo)準(zhǔn)信息分析-高級(jí)信息分析


案例分析
        案例(1)免疫組庫測序揭示肝癌組織TCR多樣性及其意義(由華銀高通量完成)

        T淋巴細(xì)胞通過特異性T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別抗原肽,在人類適應(yīng)性免疫應(yīng)答中扮演著重要角色。TCR多樣性與宿主免疫反應(yīng)及腫瘤預(yù)后密切相關(guān)。盡管腫瘤浸潤性T淋巴細(xì)胞對(duì)腫瘤預(yù)后有一定的影響,但很少有研究對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)肝細(xì)胞癌(HCC)中的腫瘤組織和非腫瘤組織中的TCR多樣性進(jìn)行詳細(xì)地特性描述。本研究對(duì)來自48位HBV相關(guān)HCC患者的肝癌腫瘤組織進(jìn)行免疫組庫測序。與癌旁組織相比,腫瘤組織CDR3氨基酸(aa)克隆型具有顯著較高的平均數(shù)(2259 vs.1324,p<0.001),TCR多樣性顯著升高(Gini協(xié)同系數(shù),p<0.001;Simpson指數(shù),p<0.01;Shannon熵,p<0.001)。對(duì)中央Morisita-Horn相似指數(shù)(MHSI)的分析顯示,在腫瘤組織與癌旁組織之間TCR庫相似性較弱。本研究在肝癌患者腫瘤中觀察到T淋巴細(xì)胞具有廣泛的異質(zhì)性,以及在相鄰癌旁組織中有較高的HEC。腫瘤組織和癌旁組織中差異化T細(xì)胞庫顯示了乙肝相關(guān)性肝癌患者體內(nèi)獨(dú)特的T細(xì)胞免疫微環(huán)境。 



圖1 腫瘤及癌旁組織中Vβ和Jβ基因片段使用頻率熱圖


圖2 CDR3 aa克隆類型多樣性的分析


        案例(2)大規(guī)模t細(xì)胞受體測序闡明CD8+淋巴細(xì)胞在拉斯穆森腦炎中的致病機(jī)理

        拉斯穆森腦炎(Rasmussen encephalitis, RE)是一種罕見的兒科癲癇疾病伴隨有半腦炎癥和進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)缺陷。為了闡明RE的免疫反應(yīng)過程,德國明斯克大學(xué)神經(jīng)學(xué)研究所對(duì)RE患者的22例血液,2例腦脊液,和5例腦組織切片樣本還有兒科樣本參照進(jìn)行T細(xì)胞受體(TCR)測序。RE患者樣本表現(xiàn)為外周CD8+T細(xì)胞的擴(kuò)散程度與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。此外,在CNS中,RE是唯一的具有T細(xì)胞擴(kuò)散的兒科癲癇疾病。同時(shí)提示在RE中,外周擴(kuò)散的CD8+淋巴細(xì)胞的抗原特異性會(huì)侵害CNS,可通過限制其進(jìn)入CNS來改善。 


圖1RE患者的TCR組庫嚴(yán)重受限制


圖2 RE患者特異性的克隆中CDR3區(qū)和Vβ基因的長度分布
            

圖3 中樞神經(jīng)系統(tǒng)干細(xì)胞移植前后TCR組庫的情況及不同樣本間共享的克隆類型

        案例(3)個(gè)體遺傳差異導(dǎo)致獨(dú)特的淋巴細(xì)胞受體和抗原細(xì)胞

        適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的保護(hù)機(jī)體的能力是需要不同的淋巴細(xì)胞抗原受體完成的。然而個(gè)體差異基因和后天因素導(dǎo)致的差異和影響還沒有被完全闡釋。斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院通過對(duì)5對(duì)同卵雙生雙胞胎的B、CD4+ T和CD8+ T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析,來量化遺傳因素在V(D)J重組過程和胸腺選擇中的影響。選取PBMC進(jìn)行RNA提取后利用反轉(zhuǎn)錄獲得目的片段并構(gòu)建免疫組文庫,使用Miseq進(jìn)行2x300 bp測序,最后分析免疫組庫的差異性。



圖1 遺傳性因素影響的未成熟細(xì)胞的基因使用分析圖


圖2 未成熟細(xì)胞和記憶細(xì)胞的CDR3區(qū)域特征遺傳傾向性

參考文獻(xiàn)
[1] Chen et al. High-throughput T cell receptor sequencing reveals distinct repertoires between tumor and adjacent non-tumor tissues in HBV-associated HCC. OncoImmunology, 2016.   
[2] Schneider-Hohendorf et al. CD8+ T-cell pathogenicity in Rasmussen encephalitis elucidated by large-scale T-cell receptor sequencing. Nature Communications, 2016.                 
[3] Rubelt et al. Individual heritable differences result in unique cell lymphocyte receptor repertoires of na?ve and antigen-experienced cells. Nature Communications, 2016.