iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技術是生物學領域應用廣泛的兩種蛋白質標記定量技術。iTRAQ/TMT試劑由報告基團、平衡基團和反應基團三個基團構成。反應基團與肽段相連接使iTRAQ/TMT試劑結合在肽段上，在一級譜圖中，不同樣本的同一肽段，標記后表現為相同的質荷比。在二級譜圖中，報告基團、平衡基團和反應基團之間的鍵斷裂，帶不同同位素標簽的同一肽段產生質量不同的報告離子，根據報告離子的豐度可獲得樣本間相同肽段的定量信息。
質譜儀
FusionLumos、Q Exactive HF、Oribtrap、Q TOF 6600
技術優勢
定量準確：基于高效的鑒定軟件和嚴格的過濾條件，控制鑒定結果的可靠性
適用性廣：適用于所有物種的各類樣本
檢測通量高：一次可檢測8個樣本
蛋白數量多：能鑒定高達10000種蛋白
技術流程
實驗流程
信息分析
生信分析總流程
標準信息分析
（1）蛋白鑒定
（2）蛋白功能注釋
（3）蛋白亞細胞定位
（4）蛋白定量
（5）差異蛋白篩選
（6）蛋白互作
個性化分析
（1）蛋白組+轉錄組關聯分析
（2）其余個性化分析
分析結果示例
案例分析
案例（1）腫瘤內皮細胞來源的cadherin-2促進血管生成，對肺腺癌有預后意義
本研究選取腺肺癌臨床組織分離的TECA（癌組織分離血管內皮細胞）、PECA（癌旁組織分離血管內皮細胞）及NECA（正常組織分離血管內皮細胞）進行iTRAQ蛋白組學分析和實驗驗證，發現血管蛋白Cadherin-2（CDH2）在肺癌組織和細胞中顯著上調。通過結合過表達實驗和臨床樣本評估結果，確認CDH2降解及表達的異質性導致了與癌細胞粘附和細胞遷移/增殖相關的不同調控行為。研究為證實cadherin-2作為腺肺癌臨床診斷新的分子靶標提供理論基礎。
圖1 差異蛋白表達熱圖和不同樣本組蛋白數據的PCA分析
案例（2）WDR74通過RPL5-MDM2-p53通路調節黑素瘤的發生和轉移
本研究對小鼠黑色素瘤細胞株和黑色素瘤轉移細胞株進行iTRAQ蛋白組學分析和qPCR、免疫印跡等實驗，發現并驗證了WDR74能促進細胞周期的進展和細胞增殖，并通過過表達和敲除實驗等揭示了WDR74對RPL5-MDM2-p53通路的調控作用。WDR74及其機制的研究為WDR74作為臨床預防和治療黑素瘤的候選靶點提供理論依據。
圖2 通過iTRAQ檢測到WDR74的電離肽的注釋質譜
圖3 WDR74調控RPL5-MDM2-p53通路機制圖
案例（3）利用串聯質譜標簽(TMT)標記揭示小鼠附睪脂肪組織中年齡和高脂飲食特異性蛋白質組的變化
本研究主要從不同年齡的高脂與低脂小鼠中分離附睪脂肪組織，采用TMT標記法探索年齡和高脂飲食對附睪組織中蛋白質的變化。揭示出長期高脂飲食顯著改變了55種與免疫應答和腎素-血管緊張素系統相關的蛋白質，確定了與年齡相關和高脂肪飲食特異性蛋白質組學特征，突出了精氨酸代謝對年齡增長的響應，以及支鏈氨基酸代謝對高脂肪喂養的早期響應。
圖4 附睪脂肪蛋白質組中飲食和年齡相關變化比較的實驗設置和工作流程
[1] Zhuo H, et, al. Tumor endothelial cell-derived cadherin-2 promotes angiogenesis and has prognostic significance for lung adenocarcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18:34.
[2] Li Y, et, al. WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5-MDM2-p53 pathway[J]. Oncogene, 2020, 39: 2741-2755.
[3] Plubell D L, Wilmarth P A, Zhao Y , et al. Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2017, 16(5):873-890.
